Mendelova interaktivní škola genetiky

Genová exprese aneb co kódují geny

 

 

 

  

Eva Janečková

Martina Vašíčková

 

 

 

 

 

Tribun EU

2015

Mendelova interaktivní škola genetiky: CZ.1.07/2.3.00/45.0037. Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

 

Autor/odborný garant: prof. RNDr. Eva Matalová, Ph.D.

 

Hlavní manager: RNDr. Iva Kubištová, Ph.D.

 

 

 

© Eva Janečková, 2015; Martina Vašíčková, 2015

This edition © Tribun EU, 2015

 

ISBN 978-80-263-0905-5

1 Kde všechno začíná a čím?

 

Genová exprese sestávající z transkripce a translace představuje proces tvorby proteinů, tedy podstaty všeho živého. Transkripce je přepis struktury DNA do RNA, translace je překlad informace ulo-žené v RNA do pořadí aminokyselin. Všechny tyto procesy popi-suje centrální dogma molekulární biologie (obr. 1).

Obr. 1: Centrální dogma molekulární biologie. Vytváření kopií DNA je popisováno procesem replikace. Genetická informace se přepisuje z DNA do RNA a odtud se překládá do molekuly proteinu.

 

Dalším procesem tohoto dogmatu je replikace DNA neboli zmnožení genetické informace. Centrální dogma molekulární biologie tedy zahrnuje pojmy deoxyribonukleová kyselina (DNA), ribonukleová kyselina (RNA), proteiny a vymezuje mezi nimi jasný vztah. DNA, RNA a proteiny tak přestavují základní složky všech živých systémů s těsnými, strukturními a funkčními vztahy, které jsou propojené a určují základní atributy živé hmoty.

Veškerá genetická informace je primárně zapsána v DNA a většina DNA se nachází v jádře buňky (obr. 2). Minoritní množství dále můžeme najít u živočichů v mitochondriích a u rostlin také v chloroplastech.

Studiem genetické informace, jednotlivých procesů replikace, transkripce a translace se zabývá obor molekulární biologie (obr. 3). Díky metodám, které se v několika posledních desetiletích vyvinuly do špičkových kvalit, je umožněn zisk nových výsledků objasňujících řadu nejasností.

Jedná se především o diagnostiku onemocnění, rozvoj nástrojů genového inženýrství, forenzní genetiku, detekci patogenů v prostředí, paternitní spory a základní výzkum. S oborem molekulární biologie úzce souvisí i obor genetika, zabývající se dědičností i proměnlivostí organizmů a jejími příčinami.

Obr. 2: Uložení genetické informace. Genetická informace se nachází v jádře eukaryotických buněk.

Obr. 3: Praktické využití oboru molekulární biologie a genetiky.

 

Genetický materiál plní tři základní funkce:

  • Genotypovou funkci, replikaci. Genetický materiál musí uchovávat genetickou informaci a přesně ji předávat z rodičů na potomstvo, z generace na generaci.
  • Fenotypovou funkci, genovou expresi. Genetický materiál musí řídit vývoj fenotypu organizmu. To znamená, že genetický materiál musí určovat růst organizmu od jednobuněčné zygoty až k dospělému organizmu.
  • Evoluční funkci, mutaci. Genetický materiál podléhá změnám, čímž vznikají varianty, které organizmům umožňují přizpůsobit se změnám prostředí.

2 Nukleové kyseliny a jejich struktura

 

Nukleové kyseliny patří mezi biomakromolekuly, biopolymery, což značí, že jsou to látky o vysoké molekulární hmotnosti složené z jednotlivých monomerů. Mezi zástupce nukleových kyselin patří deoxyribonukleová a ribonukleová kyselina.

Monomer DNA představuje:

  • pětiuhlíkatý cukr deoxyribózu (pentóza) (obr. 4),
  • fosfátovou skupinu (zbytek kyseliny fosforečné),
  • dusíkatou bázi (adenin, tymin, guanin, cytosin).

Jednotlivé monomery se označují jako nukleotidy (deoxyribonukleotidy). V případě RNA jsou nukleotidy označovány ribonukleotidy a skládají se z:

  • pětiuhlíkatého cukru ribózy (pentóza) (obr. 4),
  • fosfátové skupiny (zbytek kyseliny fosforečné),
  • dusíkatých bází (adenin, uracil, guanin, cytosin).

Obr. 4: Rozdíl ve strukturním vzorci deoxyribózy a ribózy. Deoxyribóza se nachází v DNA, ribóza v RNA.

Obr. 5: Rozdíl mezi nukleosidem a nukleotidem. Nukleosid představuje pětiuhlíkatý cukr, pentózu a bázi, nukleotid obsahuje navíc fosfátovou skupinu.

Deoxyribonukleotidy a ribonukleotidy jsou spojeny fosfodiesterovými vazbami (obr. 6). Syntéza (tvorba) těchto řetězců se uskutečňuje ve směru 5ʹ-3ʹ, je tedy orientovaná.

Obr. 6: Polynukleotidový řetězec. Je vytvořený spojením jednotlivých deoxyribonukleotidů fosfodiesterovými vazbami. Na každém polynukleotidovém řetězci můžeme odlišit jeho 5ʹ- a 3ʹ-konec.

2.1 Deoxyribonukleová kyselina

 

DNA je obsažena v buňkách všech organizmů a virových částicích kromě RNA virů. Struktura deoxyribonukleové kyseliny, známá dvoušroubovice, byla odhalena roku 1953: James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin, Maurice Wilkins (obr. 7). Rosalind Franklin a Maurice Wilkins k tomuto objevu přispěli výsledky svých krystalografických pokusů.

DNA se vyskytuje ve formě dvouřetězce jako dsDNA (double-stranded DNA). Skládá se ze dvou komplementárních, antiparalelně orientovaných polydeoxyribonukleotidových řetězců. Komplementarita bází určuje pravidlo, že adenin (A) se páruje s tyminem (T) a je mezi nimi vazba o dvou vodíkových můstcích a cytosin (C) s guaninem (G) vazbou tří vodíkových můstků (obr. 8).

 

Obr. 7: Objevitelé struktury DNA. Dvoušroubovicový model DNA poprvé představen roku 1953 v časopise Nature.

Obr. 8: Komplementarita bází v DNA. Dusíkaté báze se mezi sebou párují prostřednictvím vodíkových můstků.

 

V dsDNA můžeme pozorovat opačnou orientaci řetězců, přičemž proti 5ʹ-konec jednoho řetězce vždy leží 3ʹ-konec druhého řetězce a naopak (obr. 9).

Obr. 9: Antiparalelita řetězců a jednotlivé báze. Adenin a guanin se řadí mezi purinové báze, cytosin s tyminem mezi pyrimidinové.

 

Přerušení vodíkových můstků spojujících oba řetězce se nazývá denaturace (obr. 10). Denaturace probíhá za účinku vyšších teplot (94–96 °C) a dále za přítomnosti určitých chemických látek. S procesem denaturace souvisí pojem teplota tání Tm (melting temperature) definovaná jako teplota, při které zdenaturuje 50 % dvoušroubovicových molekul DNA. Tímto poukazuje na orientační složení konkrétní dsDNA, uplatňuje se při analýze DNA, hybridizaci nukleových kyselin a různých metodách molekulární biologie. Tm závisí na řadě faktorů, kterými jsou například pH, iontová síla roztoku, přítomnost kationtů, ale i zastoupení A-T a G-C párů atd.

Proces denaturace je vratným procesem, a pominou-li podmínky pro denaturaci, řetězce se mohou znovu spojit (renaturace). Při procesu denaturace dochází k zesílení absorbance při přechodu dvouvláknové DNA na jednovláknovou (hyperchromní efekt).

Obr. 10: Denaturace DNA, teplota tání. Denaturace DNA je rozpojení dvou vláken dvoušroubovice. Teplota tání zobrazená na grafu, definovaná jako teplota, při které denaturovalo 50 % všech molekul DNA přítomných v roztoku.

Při podrobnějším pohledu na strukturu DNA můžeme rozlišit několik struktur. Primární strukturou DNA se rozumí sekvence deoxyribonukleotidů v řetězci. Sekundární strukturu DNA představuje již zmiňovaná dvoušroubovice (helix) skládající se ze dvou komplementárních antiparalelně orientovaných polydeoxyribo-nukleotidových řetězců ovíjejících pomyslnou společnou osu a uspořádaných tak, že páry bází (spojené vodíkovými vazbami podle Watsonova-Crickova pravidla) směřují dovnitř šroubovice a oporná deoxyribózofosfátová kostra na povrch šroubovice. Vzájemným obtáčením komplementárních řetězců se vytváří dvoušroubovicové vinutí. Sekundární struktura DNA může přecházet ve strukturu primární a naopak v závislosti na fyzikálně-chemických podmínkách prostředí.

Terciární struktura DNA za vzniku nadšroubovice (superhelix). Toto nadšroubovicové vinutí může být záporné či kladné.

Dvoušroubovice DNA je u eukaryotických organizmů uložená v jádře v komplexu s proteiny (chromatin) a tvoří významnou složku buněčného jádra (chromozomů). Základní stavební jednotkou chromatinu je nukleozom (obr. 11).

Obr. 11: Sbalování DNA. Dvoušroubovice DNA tvoří komplex s histony (proteiny), který se nazývá chromatin. Základní stavební jednotkou chromatinu je nukleozom (část vlákna DNA s histony). Na obrázku zleva jsou znázorněny: DNA, DNA a bílkoviny (histony), chromatin s centromerou, kondenzovaný chromatin, chromozom.

2.2 Ribonukleová kyselina (RNA)

 

Ribonukleová kyselina se podílí na realizaci (expresi) genetické informace. Kromě toho u RNA organizmů, zejména u RNA virů je nositelkou genetické informace zakódované v její primární struktuře.

Ribonukleová kyselina, oproti deoxyribonukleové kyselině, se nejčastěji vyskytuje ve formě jednořetězce.

V buňkách prokaryot i eukaryot se vyskytují tři základní druhy RNA:

  • mediátorová/informační ribonukleová kyselina (mRNA),
  • ribozomová nukleová kyselina (rRNA),
  • transferová ribonukleová kyselina (tRNA).

RNA můžeme hodnotit na několika strukturních úrovních: primární, sekundární a terciární. Primární strukturou se rozumí sekvence ribonukleotidů v řetězci RNA. Sekundární struktura vzniká vytvořením dvouřetězcové molekuly RNA, respektive dvouřetězcových úseků v molekule RNA spojováním komplementárních bází vodíkovými můstky. Sekundární struktura RNA může mít podobu dvoušroubovice (krátké úseky mRNA a rRNA), nebo jetelového listu (tRNA). Dalšími interakcemi může vzniknout i struktura terciární.

mRNA vzniká transkripcí strukturních genů umístěných na DNA a plní funkci matrice při biosyntéze polypeptidového řetězce na ribozomu (obr. 12).

Obr. 12: Struktura mRNA. mRNA je lineární molekula syntetizující se v buněčném jádře podle jednoho z řetězců DNA, prodlužuje se ve směru 5ʹ-3ʹ.

 

Počet transferových RNA souvisí s počtem aminokyselin. Kromě standardních bází obsahuje i několik nestandardních a vytváří tak sekundární strukturu s charakteristickým tvarem „jetelového listu“ (obr. 13), v rámci kterého můžeme rozlišit akceptorové, pseudouridinové, antikodonové a dihydrouridinové rameno. Antikodonové rameno vytváří smyčku, ve které je lokalizován antikodon (triplet komplementární k příslušnému tripletu – kodonu – mRNA). tRNA je schopna vytvářet i strukturu terciární úzce související s proteosyntézou na ribozomech. Každá tRNA, účastnící se procesu translace na ribozomu, má na svém akceptorovém rameni navázanou molekulu aminokyseliny, odpovídající danému kodonu.

Obr. 13: Struktura tRNA. Antikodonové rameno s antikodonem. Akceptorové rameno vázající příslušnou aminokyselinu. Sekundární struktura má charakteristický tvar tzv. „jetelového listu“.

 

Poslední typ RNA, ribozomální RNA, se podílí především na stavbě ribozomů (obr. 14) a spoluúčastní se procesů, které se na nich realizují (čtení/překlad genetické informace – translace a tvorba proteinů – proteosyntéza).

Obr. 14: Struktura rRNA. rRNA struktura je složitá a rozvětvená, spolu s proteiny tvoří útvar zvaný ribozom, místo, na kterém probíhá proces translace.

 

 

3 Replikace

 

Genetická informace je uložena ve všech buňkách našeho těla. Existují však i výjimky, buňky, které ve svém diferencovaném stavu DNA neobsahují. Takovými buňkami jsou v lidském těle erytrocyty (červené krevní buňky) a trombocyty (krevní destičky).

Počátek replikace (místo ori) je specifickým úsekem DNA, od kterého se začíná tvořit tzv. replikační vidlice. Molekula DNA nebo její část, která obsahuje počátek replikace, se nazývá replikon. Replikace se uskutečňuje podle matričního řetězce (templát) enzymaticky katalyzovanou polymerací deoxyribonukleotidů ve směru 5ʹ → 3ʹ na základě komplementarity bází.

 

Obr. 15: Replikace DNA. Replikace je (a) semikonzervativní: do každé dceřiné buňky přechází dvoušroubovice tvořená jedním původním a jedním novým řetězcem DNA, a (b) semidiskontinuální: na vlákně 5ʹ-3ʹ probíhá syntéza nového řetězce kontinuálně, na vlákně 3ʹ-5ʹ probíhá diskontinuálně, po úsecích zvaných Okazakiho fragmenty. Důvodem je schopnost práce polymerázy pouze v jednom směru, a to 5ʹ-3ʹ.

Replikace je:

  • semidiskontinuální – jeden řetězec je syntetizován kontinuálně (tzv. vedoucí), kdežto druhý řetězec (tzv. opožďující se) je syntetizován diskontinuálně v úsecích označovaných jako Okazakiho fragmenty,
  • semikonzervativní – každá replikovaná dsDNA sestává z jednoho řetězce pocházejícího z původní molekuly dsDNA (tj. před replikací) a z jednoho řetězce nově syntetizovaného (obr. 15).

 

Replikace je vícestupňový proces (iniciace, elongace, terminace) a je enzymaticky katalyzovaný DNA polymerázou, nukleázami, ligázou a dalšími enzymy.

4 Transkripce

 

Transkripce je složitý, enzymaticky katalyzovaný a autoregulovaný proces probíhající, stejně jako replikace, v buněčném jádře. V průběhu transkripce je syntetizována mediátorová ribonukleová kyselina (mRNA, messenger RNA, primární transkript) podle matričního řetězce (templátu) DNA.

U eukaryot je primárním transkriptem zpravidla premediátorová RNA či heteronukleární RNA (premRNA, hnRNA), která je posttranskripčně upravována po transportu z buněčného jádra do cytoplazmy. Mezi posttranskripční úpravy patří zejména:

  • úprava konců premRNA související se stabilizací molekuly RNA, jejím transportem do cytoplazmy a částečnou ochranou před účinkem ribonukleáz:
  • čepička na 5ʹ-konci (m7G)
  • polyadenylace na 3ʹ-konci
  • sestřih – odstranění určitých úseků (intronů), které se nepřekládají do primární struktury polypeptidového řetězce.

Trojice po sobě jdoucích nukleotidů mRNA, triplety, jsou označovány jako kodony. Jeden kodon zpravidla odpovídá určité aminokyselině. Pokud kodony determinují aminokyseliny v polypeptidovém řetězci, říkáme, že mají smysl. Naproti tomu kodony, které nekódují žádnou aminokyselinu, jsou nesmyslné, beze smyslu (nonsense). Některé z těchto nesmyslných kodonů však zastávají důležité funkce:

  • signalizují začátek syntézy řetězce (iniciační kodon AUG),
  • signalizují konec syntézy řetězců (terminační kodony UAA, UAG, UGA).

Důležitou informací spojenou s procesem transkripce je, že genetická informace se nepřepisuje kontinuálně po celé délce molekuly DNA, ale po určitých úsecích.

V tomto místě je také důležité rozlišení negativního a pozitivního řetězce. RNA polymeráza, enzym zahajující transkripci, rozpozná, na kterém místě se má na dvojvlákno DNA navázat a které vlákno zvolit pro „čtení“. A také ví, že se může pohybovat pouze v jednom směru, který je dán orientací 5ʹ- a 3ʹ-konce. Geny zaujímají jen omezenou část molekuly DNA, zaujímají určité místo (lokus) na chromozomu. Takové úseky DNA, které jsou transkribovány, se označují jako transkripční jednotky vyznačující se obecně platným uspořádáním (obr. 16). Transkripční jednotka může obsahovat pouze jeden nebo více přepisovaných genů. Na počátku každé transkripční jednotky se nachází tzv. startovací nukleotid, označovaný +1. Transkripční jednotka je zakončena regulační oblastí zvanou terminátor (polyadenylační signál). Před startovacím nukleotidem (tj. vlevo od +1) se nachází regulační oblast, která se nepřepisuje. Touto oblastí je tzv. promotor, na který se váží proteiny nezbytné pro zahájení transkripce. Transkripční jednotka bez promotoru či s poškozeným promotorem nemůže být transkribována.

Obr. 16: Struktura transkripční jednotky. Na promotor se váže RNA polymeráza zahajující proces transkripce. Transkripční jednotka může obsahovat jeden či více genů a je ukončena terminátorem.

V buňkách se zpravidla přepisuje pouze jeden z obou řetězců dsDNA (obr. 17):

  • řetězec plnící funkci matrice = řetězec negativní, nekódující, toto vlákno má komplementární sekvenci k syntetizované mRNA,
  • řetězec neplnící funkci matrice = pozitivní, kódující – má stejnou sekvenci (pouze místo T je U) jako výsledná mRNA, která vzniká transkripcí tohoto genu.

Obr. 17: Transkripce. Proces transkripce představuje přepis ze struktury DNA do RNA. Funkci matrice (templátu) tvoří negativní řetězec DNA.

Transkripce představuje vícestupňový proces (iniciace, elongace, terminace) katalyzovaný enzymy (RNA polymeráza) za účasti řady regulačních transkripčních faktorů.

5 Translace

 

Translace představuje druhý krok genové exprese. Při tomto procesu se s jednotlivými kodony (jejichž pořadí v molekule mRNA determinuje pořadí aminokyselin v konkrétním řetězci) dočasně komplementárně spojují příslušné druhy tRNA takzvanými antikodony, tj. triplety lokalizovanými v jejich antikodonovém rameni (obr. 18).

Obr. 18: Vzájemný vztah kodonu, antikodonu a aminokyseliny. Dochází k párování antikodonu s kodonem. Kodon je součástí molekuly mRNA, antikodon molekuly tRNA, která s sebou přináší i příslušnou aminokyselinu.

Lineárním řazením jednotlivých molekul tRNA s navázanými aminokyselinami komplementárně k sekvenci ribonukleotidů RNA jsou při translaci na ribozomu vytvořeny podmínky pro vznik peptidové vazby mezi karboxylovou skupinou jedné aminokyseliny a aminoskupinou sousední (následující) aminokyseliny (obr. 19).

Obr. 19: Translace. Translace je překlad genetické informace ze struktury RNA do molekuly proteinu.

Translace probíhá podle univerzálního genetického kódu, který je tripletový a degenerovaný. Je to velmi složitý a komplexní proces, k jehož realizaci je zapotřebí několika základních složek: mRNA, soubor tRNA, soubor standardních aminokyselin, ribozomy, zdroje energie, sada enzymů a faktorů.

Na povrchu ribozomů, sestávajícím ze dvou podjednotek (obr. 20), jsou rozložena různá specifická vazebná místa:

  • aminoacylové místo (A-místo) = místo vstupu a navázání aminokyseliny s tRNA,
  • peptidylové místo (P-místo) = místo navázání peptidyltRNA,
  • výstupní místo pro deacylovanou tRNA (E místo),
  • peptidyltransferázové místo,
  • vazebná místa pro iniciační a elongační faktory.

Obr. 20: Schematická struktura ribozomu. Ribozom je tvořen velkou (oranžová) a malou (modrá) podjednotkou.

Proces translace můžeme opět rozdělit do tří základních fází: iniciace, elongace a terminace katalyzované iniciačními, elongačními, respektive terminačními faktory.

 

Již během procesu translace probíhají různé úpravy nově vznikajících proteinů (kotranslační úpravy), tyto jsou později doplněny úpravami po skončení celého procesu (posttranslační úpravy). Výsledkem těchto úprav je vznik funkčního polypeptidového řetězce. Mezi nejznámější kotranslační a posttranslační úpravy patří: odštěpení N-koncové aminokyseliny nebo skupiny aminokyselin u některých řetězců, chemické modifikace (metylace, fosforylace, hydroxylace, glykozylace) či tvorba disulfidických vazeb, vytvoření kvartérní struktury proteinu a formování supramolekulárních struktur.

6 Základní jednotka genetické informace, gen

 

Gen definovaný jako určitý úsek molekuly DNA obsahuje informaci o primární struktuře určitého proteinu, tRNA, rRNA nebo o vazbě specifických molekul proteinů k molekule DNA.

Soubor veškeré genetické informace (všech genů) v organizmu se označuje jako genom.

Uveďme si nyní zjednodušený příklad homologického páru chromozomů diploidní buňky, na kterém je lokalizován gen tvořený dvěma alelami (dominantní A, recesivní a). Může se tedy vyskytnout jedna ze tří možných kombinací, které určují tzv. genotyp:

  • jsou-li obě alely dominantní, vznikne genotyp AA, jehož nositel je označován jako dominantní homozygot,
  • jsou-li obě alely recesivní, vznikne genotyp aa, jehož nositel je označován jako recesivní homozygot,
  • je-li na příslušném lokusu jednoho chromozomu alela dominantní (A) a na příslušném lokusu druhého chromozomu uvažovaného páru homologických chromozomů alela recesivní (a), vznikne genotyp Aa, jehož nositel je označován jako heterozygot.

Genotyp je tedy konkrétní formou genomu jedince, reprezentovanou určitou sestavou alel. Vnější vyjádření genotypu v podobě geneticky determinovaných, podmíněných nebo ovlivněných biologických znaků individua je označováno jako fenotyp. Podle fenotypového projevu jednotlivých genotypů můžeme vymezit několik základních typů dědičnosti (obr. 21):

  1. Úplná dominance – fenotypový projev dominantního homozygota je shodný s fenotypovým projevem heterozygota a je odlišný od fenotypového projevu recesivního homozygota. Jeden fenotyp tedy může být vyjádřen více genotypy, které se musí určit jedině genetickou analýzou nebo zpětným křížením.

2. Neúplná dominance – fenotypový projev heterozygota leží blíže k fenotypovému projevu některého z homozygotů, avšak nikoli právě uprostřed mezi nimi. V tomto případě lze také na základě fenotypu stanovit genotyp.

3. Bez dominance – fenotypový projev heterozygota leží uprostřed mezi fenotypovým projevem dominantního a recesivního homozygota. V tomto případě lze na základě fenotypu stanovit genotyp.

4. Kodominance – každý z genotypů má vlastní specifický projev.

Obr. 21: Základní typy dědičnosti. Fenotypový projev genotypů: úplná a neúplná dominance, bez dominance (obrázek nahoře) a kodominance (obrázek dole). U kodominance se v heterozygotním fenotypu projeví obě alely vedle sebe, aniž by se vzájemně potlačovaly.

Základy dědičnosti a výše zmíněné informace byly objasněny otcem genetiky, J. G. Mendelem, již v polovině 19. století. Jeho pokusným organizmem byl hrách setý, Pisum sativum, který pěstoval v klášterní zahradě v Brně a zkoumal sedm znaků hrachu (obr. 22).

Obr. 22: Sedm znaků hrachu pozorovaných Mendelem. Ve svých pozorováváních se zaměřoval na semeno, květ, lusk a stonek hrachu setého (Pisum sativum).

 

Mendelovu práci můžeme shrnout do tří Mendelem objevených základních principů:

  1. Princip dominance: u heterozygota může jedna alela překrýt přítomnost druhé alely. Některé alely se fenotypově projevují, i když jsou přítomny pouze v jedné kopii.
  2. Princip segregace: u heterozygota se dvě alely v průběhu tvorby gamet od sebe oddělují, segregují.
  3. Princip nezávislé kombinace: alely různých genů segregují, nebo jak také říkáme, kombinují se nezávisle na sobě.

Tyto principy jsou využívány a aplikovány v praxi zejména při sestavování Punnettových tabulek, metod větvení a při počítání pravděpodobnosti. V genetice člověka jsou tyto principy aplikovány při určování typu onemocnění, kdy můžeme určit, zdali je dědičnost dominantní či recesivní.

Znaky podmíněné dominantními alelami se rozpoznávají nejsnáze. Obvykle se u každého jedince, který nese dominantní alelu, daný znak projeví, což umožňuje v rodokmenu vysledovat přenos dominantní alely. Recesivní znaky nelze tak snadno rozeznat, poněvadž se mohou vyskytovat u jedinců, u jejichž rodičů se znak neprojevoval. Ke zjištění přenosu recesivní alely je někdy zapotřebí sledovat v rodokmenu více generací (obr. 23).

Obr. 23: Dominantní a recesivní dědičnost. Sledování dominantní alely (nalevo) a recesivní (napravo) v rodokmenu.

Mezi onemocnění s dominantní dědičností patří například: achondroplazie (zakrslost), brachydaktylie (krátké prsty), Huntingtonova choroba (neurologická porucha), vlasová linie nad čelem do špičky, vlnité vlasy.

Mezi onemocnění s recesivní dědičností patří: albinizmus (chybění pigmentu), ataxia telangiectasia (neurologická porucha), cystická fibróza (porucha dýchání), Duchennova svalová dystrofie, srpkovitá anémie atd.

Jak jsme si již několikrát uvedli, každý gen kóduje odlišný polypeptid. Funkce těchto polypeptidů pak ovlivňuje fenotypový projev organizmu. Fenotyp může být ovlivněn i prostředím. Působení genů od genotypu k fenotypu je tedy složité. Do základních principů dědičnosti a ovlivnění exprese genů u člověka tak musíme zahrnout:

  • vliv prostředí – strava, vnitřní prostředí organizmu (hormony),
  • penetranci (pronikavost uplatnění určitého genotypu) – neúplná penetrance se vyskytuje, pokud se u jedinců neprojevuje určitý znak, ačkoli má odpovídající genotyp,
  • expresivitu (míra nebo stupeň projevu určitého genu) – znak se nemanifestuje stejným způsobem u všech jedinců, kteří ho nesou,
  • genové interakce – dva nezávisle segregující geny mohou ovlivňovat jeden znak, různé kombinace alel těchto dvou genů pak vedou k rozdílným fenotypům, pravděpodobně kvůli interakcím kódovaných produktů na biochemické nebo buněčné úrovni,
  • epistázi – určitý znak je ovlivněn dvěma nebo více geny, alela jednoho z nich může mít na fenotyp prvořadý účinek, jestliže alela má takovýto nadřazený vliv, označuje se jako epistatická vůči dalším genům, které se na fenotypu podílejí,
  • pleiotropii – v případě pleiotropie gen ovlivňuje v rámci fenotypu více znaků.

Další odlišnosti od základních Mendelových principů představují geny vázané na pohlaví u člověka. Můžeme pozorovat recesivní X-vázané znaky identifikovatelné mnohem snáze než znaky rece-sivně autozomové. U muže stačí k projevu X-vázaného znaku pouze jedna zděděná recesivní alela, aby se daný znak projevil u ženy, musí být zděděny obě alely – jedna od každého z rodičů. Z toho vyplývá, že převážná část lidí, u kterých se projevují X-vázané znaky, jsou muži. Mezi taková onemocnění patří například hemofilie, X-vázaná porucha srážlivosti krve a barvoslepost. Existují i Y-vázané znaky, které se přenáší z otce na syna.

7 Regulace genové exprese u eukaryot

 

Genová exprese u eukaryot může být regulována na úrovni transkripce, posttranskripčních úprav nebo translace.

U eukaryot je významná časoprostorová regulace. Mnohobuněčné organizmy obsahují asi 250 rozdílných typů buněk, které jsou organizovány do tkání a orgánů. Určitý gen tak může být exprimován například v krevních buňkách, ale ne v buňkách svalových. Takovéto regulace jsou základem komplexity mnohobuněčných eukaryot.

Rozčlenění eukaryotické buňky dále izoluje jednotlivé kroky genové exprese. Transkripce se odehrává v jádře, kde jsou RNA-transkripty i upraveny přidáním čepičky, polyadenylací a odstraněním intronů. Výsledná mRNA je pak exportována do cytoplazmy, kde se spojuje s ribozomy, které se většinou nachází na membránách endoplazmatického retikula nebo volně v cytoplazmě.

Ke kontrole transkripce je zapotřebí důkladně propracovaných systémů vnitřní signalizace a komunikace. Tato regulace je zprostředkovaná interakcemi DNA s proteiny. Pozitivní i negativní regulační proteiny se vážou na specifická místa DNA a stimulují nebo inhibují transkripci. Tyto proteiny se nazývají transkripční faktory. Dnes je známo mnoho různých typů transkripčních faktorů, jež mají charakteristické domény, které jim umožňují interakce s DNA.

Dalším stupněm regulace je alternativní sestřih RNA, který je zprostředkován na tzv. spliceozomech. Alternativní sestřih se vyskytuje u některých proteinů a nabízí několik možností sestřihu. Typickým příkladem alternativního sestřihu je exprese genu pro troponin T, což je protein nacházející se v kosterním svalstvu obratlovců (obr. 24).

Obr. 24: Alternativní sestřih. Transkripty některých genů obsahují několik variant sestřihu. O tom, která bude aplikována, rozhoduje například to, v které tkáni se transkript nachází.

 

Významným bodem regulace je také způsob degradace mRNA.

Genová exprese eukaryot může být indukována faktory prostředí, jako je teplo a světlo, signální molekuly (hormony, růstové faktory). Transkripce eukaryotických genů je regulována interakcemi mezi proteiny a sekvencemi DNA uvnitř nebo poblíž genů (promotor, transkripční faktory, zesilovače transkripce atd.).

8 Geny jako funkční nástroj

 

V posledním desetiletí 20. století se rozvinul výzkumný projekt s názvem Projekt lidského genomu, který roku 2001 vyústil v úplnou analýzu vzorků lidské DNA.

Jeden gen od druhého je odlišitelný na základě sekvence bází. Cílem Projektu lidského genomu tedy bylo stanovit pořadí bází celého genomu (sekvenovat DNA), přibližně tří miliard nukleotidových párů v lidské DNA, a určit funkci genů v ní přítomných.

Počet genů lidského organizmu byl stanoven na 20 000 až 25 000, tyto byly rozděleny podle své lokalizace, struktury a možné funkce. Funkce všech genů však ani v dnešní době není zdaleka objasněna.

Většina genů obsahuje instrukce pro syntézu proteinů (soubor všech různých proteinů daného organizmu se nazývá proteom). Další geny kódují molekuly RNA. Proteiny plní spoustu důležitých funkcí, bez nichž, či bez jejichž souhry, se organizmus neobejde.

Jako příklad si uveďme protein β-globin, který je součástí hemoglobinu, proteinu, který přenáší kyslík v krvi. Pokud dojde k nepatrné změně (mutaci) na úrovni DNA, konkrétně k záměně jednoho nukleotidu v tripletu GAG na GTG, dojde k patřičné změně i na úrovni mRNA, a tím pádem je ve výsledku glutamová kyselina (Glu) zaměněna za valin (Val). A tato změna, mutace, způsobuje změnu tvaru červených krvinek, které budou srpkovitého tvaru a nebudou přenášet kyslík v buňkách dostatečně účinně (obr. 25).

V populaci se samozřejmě mohou vyskytnout i heterozygoti, tedy takoví jedinci, kteří nesou jak mutantní, tak i standardní (nemutovanou) alelu tohoto genu, ti mají v populaci výhodu, jsou méně náchylní k infekci krevním parazitem způsobujícím malárii. Tito lidé mají tak větší šanci na přežití v oblastech, kde malárie hrozí.

Obr. 25: Srpkovitá anémie. Mutace v genu pro β-globin projevující se morfologickou změnou červených krvinek.

 

Genetický materiál mnoha druhů může být také obohacen vnesenými cizími geny, tímto způsobem vznikají geneticky modifikované organizmy (GMO). Takto byla získána například geneticky modifikovaná kukuřice odolná vůči určitému druhu hmyzu či geneticky upravená „zlatá rýže“, která nejen zabraňuje v chudých oblastech hladu, ale navíc obsahuje vitamin A. GMO však stále ještě představují velice diskutabilní téma.

Obr. 26: Ilustrační fotografie bakteriální kultury.

 

Konkrétní a běžně používaný příklad je vyrábění lidského inzulinu a růstového hormonu pomocí geneticky upravených bakterií (obr. 26).

 

Lidská genová terapie je dalším oborem, který využívá k léčbě nemocí molekulárněgenetické technologie. Strategií tohoto typu léčby je vložit zdravou, funkční kopii určitého genu do buněk jedince, který nese pouze mutantní kopie tohoto genu (obr. 27). Vložený gen následně může kompenzovat funkci chybných genů, které jedinec zdědil. Takto popsaná lidská genová terapie je zatím ve stadiu experimentů.

Obr. 27: Genová terapie. Budoucnost léčby genetických onemocnění.

 

9 Metody molekulárních analýz

 

Známe již tedy strukturu nukleových kyselin i základní informace o procesech, které podstupují. Seznamme se nyní s metodami molekulárních analýz, které umožňují manipulaci s nukleovými kyselinami a proteiny, včetně jejich mnohostranného využití v mnoha odvětvích.

 

9.1 Izolace nukleových kyselin

 

Prvním krokem při práci s nukleovými kyselinami je jejich izolace, ke které existuje několik principiálně odlišných metod. Na začátku je vždy potřebná lýza buněk, ze kterých chceme nukleové kyseliny získat. Obvykle stačí destrukce biomembrán a denaturace proteinů detergentem. Pro lýzu tkání či rostlinných buněk s buněčnou stěnou však musí být použita určitá forma mechanické síly (například speciální přístroj – vortex, drcení tekutým dusíkem atd.). Obecně je používán lyzační roztok, jehož součástí je mimo jiné i proteináza K, která štěpí bílkoviny. Buněčný obsah (včetně nukleových kyselin) je uvolněn z lyzovaných buněk do roztoku, jehož nezbytnou součástí je kromě detergentů i EDTA chelatující ionty vápníku, které jsou potřebné jako kofaktor nukleáz.

Tradiční metodou pro izolaci nukleových kyselin je fenolchloroformová extrakce, která ponechává nukleové kyseliny rozpuštěné ve vodném prostředí (pufru) a odstraňuje ostatní znečisťující složky lyzátu, především proteiny (obr. 28).

Při této metodě je k lyzátu buněk přidána směs fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu. Vzhledem k tomu, že chloroform je organické rozpouštědlo, nemísí se s vodným roztokem a směs se rozdělí na dvě fáze – horní vodnou a dolní chloroformovou.

Při protřepávání těchto dvou fází dochází k jejich mísení a srážení proteinů ve vodném lyzátu fenolem. Izoamylalkohol zvyšuje rozpustnost fenolu v chloroformu, takže po skončení protřepávání přejde fenol do chloroformové fáze. Poté je roztok odstředěn pro dokonalé oddělení fází. Na rozhraní mezi fázemi se obvykle objeví bílý prstenec sražených proteinů. Nukleové kyseliny jsou v horní vodné fázi.

Obr. 28: Výsledek izolace nukleových kyselin pomocí fenolchloro-formové extrakce. Nukleové kyseliny se nacházejí v horní vodné fázi. Naspodu zkumavky se nachází směs fenolu a chloroformu. V mezifázi se nachází především bílkoviny.

 

Tento postup je potřeba několikrát opakovat pro dokonalé odstranění proteinů. Nakonec je nutné extrahovat ještě jednou směsí jen chloroformu s izoamylakoholem (24 : 1), aby byly odstraněny i stopy fenolu z roztoku. Z přečištěného vodného roztoku je možné nukleové kyseliny vysrážet přidáním koncentrovaného etanolu. Po centrifugaci se nukleové kyseliny jeví ve formě sedimentu (peletu) na dně zkumavky. Bílá barva je způsobena přítomností solí, které zvyšují účinnost srážení nukleových kyselin a později se odstraní 70% etanolem.

V tomto roztoku převažuje RNA, které je v buňce více než 95 %. Pokud bychom chtěli pracovat s DNA, RNA bychom museli odstranit, a to působením enzymu RNázy. Další metodou izolace nukleových kyselin je adsorpce na silikát v komerčně připravených kitech (izolace tzv. přes kolonky). Jednotlivé roztoky jsou zde promývány přes kolonku (filtr se zachycenými částicemi) a výsledkem je izolace nukleové kyseliny.

Nezbytným krokem po izolaci nukleových kyselin je měření jejich koncentrace. Při většině metod molekulárních analýz totiž musíme přidávat definované množství nukleové kyseliny, musíme znát tedy její koncentraci, abychom do reakce použili její správné množství. Nejjednodušším přístupem k měření koncentrace nukleových kyselin je použití přístroje Nanodrop (mikroobjemový UV-Vis spektrofotometr) (obr. 29). Tento postup poukáže i na čistotu vzorku stanovenou z poměru absorbancí při 260 a 280 nm.

 

Obr. 29: Nanodrop. Přístroj pro měření koncentrace a stanovení čistoty nukleových kyselin.

9.2 Restrikční štěpení

 

Restrikční štěpení nukleových kyselin je významným objevem molekulárních analýz. Izolované úseky DNA je vhodné rozštípat na menší úlomky (fragmenty), se kterými se dá lépe pracovat.

Při specifickém restrikčním štěpení nukleových kyselin se využívají enzymy restriktázy (endonukleázy), které rozpoznávají v molekule DNA krátké specifické sekvence a pouze v místě výskytu této sekvence molekulu štěpí. Nejznámější takovou restrikční endonukleázou je EcoRI (Escherichia coli, restriktáza č. 1), která rozpoznává sekvenci 5ʹ-GAATTC-3ʹ a štěpí fosfodiesterovou vazbu v řetězci mezi prvním guaninem (G) a druhým adeninem (A), a to v obou řetězcích. Vzniknou tak tzv. lepivé komplementární konce, které umožňují znovuspojení molekul. Existují i restrikční endonukleázy vytvářející tupé konce, účinnost jejich znovuspojení je však nižší (obr. 30).

 

Obr. 30: Restrikční štěpení. Restrikční endonukleázy vytvářející lepivé (EcoRI, nahoře) a tupé konce (dole). Restriktázy vždy štěpí ve specifických místech a využívají se k přípravě rekombinantních molekul.

 

Restriktázy jsou přirozenými enzymy bakterií, kde jsou součástí tzv. restrikčně-modifikačního systému, který má za úkol degradovat cizorodou DNA.

Při štěpení celkové genomové DNA získáme velké množství různě velkých fragmentů. Pokud zmiňovaného postupu využíváme ke spojení molekul ze dvou různých zdrojů, mluvíme o technologii rekombinantní DNA (vytváření nových kombinací molekul).

 

9.3 Separace molekul nukleových kyselin

 

Separace nukleových kyselin je založeno na odlišnosti v jejich délce za použití metody elektroforézy (elektromigrační dělící metoda). Jejím principem je pohyb záporně nabitých molekul nukleových kyselin (díky fosfátové skupině) ke kladně nabité elektrodě. Nosičem, který se používá pro tuto metodu, je nejčastěji gel (agaróza, polyakrylamid). Tyto vytvářejí síťovitou strukturu polymerních molekul s póry, jejich velikost lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru.

Rychlost pohybu nukleových kyselin je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Díky tomuto lze stanovit velikost fragmentu DNA srovnáním jeho elektroforetické pohyblivosti s elektroforetickou pohyblivostí fragmentů o známé délce, označovaných jako standardy velikosti nebo hmotnostní standardy (restrikční fragmenty plazmidů či genomu bakteriofágů, jejichž přesná velikost byla stanovena sekvenováním).

Gel je připraven vylitím roztoku do formy s hřebínkem, který je po vychladnutí vyjmut, a zůstanou po něm jamky k aplikaci vzorků. Gel je dále umístěn do elektroforetické vany a zalit elektroforetickým pufrem (TAE), nakonec jsou na gel naneseny vzorky, uzavřen elektrický okruh připojením ke zdroji napětí (90 V) a nyní se již molekuly nukleových kyselin pohybují rozdílnou rychlostí podle své velikosti. Abychom naše vzorky v gelu mohli vidět, přidáváme k nim nanášecí pufr, který se pohybuje podobně jako molekuly DNA. Konečná vizualizace molekul je možná například díky barvivu ethidium bromid, které je viditelné pod UV zářením (obr. 31).

Obr. 31: Elektroforéza. Roztok s fragmenty DNA je pipetou nanesen do jamek (2, 3) v elektroforetickém gelu (1). Po připojení gelu na elektrický proud dojde k oddělení fragmentů – kratší úseky prochází rychleji, jsou ve větší vzdálenosti od jamky (4). Velikost neznámého fragmentu se dá zjistit díky přítomnosti hmotnostního standardu (5, úplně vlevo), na kterém jsou fragmenty nukleové kyseliny o známé velikosti.

 

9.4 Hybridizace nukleových kyselin

 

Hybridizace nukleových kyselin je vytváření dvouřetězcových molekul z jednořetězců DNA nebo RNA za předpokladu úplné či částečné komplementarity bází. Pokud se zkoumané molekuly vyskytují ve dvouvláknové formě, je nejprve zapotřebí jejich denaturace, následovaná opětovnou renaturací. V případě některých molekulárních metod je využívána hybridizace sondy ke zkoumané molekule DNA (obr. 32).

Obr. 32: Hybridizace se značenou sondou.

Sonda v těchto případech slouží k vyhledávání určité sekvence ve vzorku testované DNA nebo RNA. Tyto sondy jsou uměle připraveny (syntetizovány), aby měly námi zvolenou sekvenci. Pomocí těchto sond můžeme např. vyšetřit přítomnost chorobné nebo zdravé alely genu nebo sledovat intenzitu exprese určitého genu v určité populaci buněk podle toho, kolik se v ní tvoří určité mRNA, apod.

Abychom zjistili, že hybridizace proběhla, musíme mít označeny molekuly použité sondy. Nejrozšířenějším způsobem značení je použití radioaktivního fosforu, využití reakce antigenu s protilátkou nebo použití fluorescenčních barviv.

Pomocí hybridizace lze vyšetřovat vzorky DNA i RNA, a to nejen izolované z buněk, ale i přímo v buňkách. Kromě zjištění přítomnosti určité sekvence ve vzorku lze pomocí hybridizace posoudit i počet kopií určité sekvence. Tento princip má využití nejen ve výzkumu, ale i v lékařské diagnostice. Některé choroby jsou charakterizovány právě změnou exprese genů – samotné geny jsou normální, ale jejich regulace, která řídí jejich expresi, je chybná a vede k vývoji choroby.

Pokud zjišťujeme přítomnost konkrétní sekvence nukleové kyseliny přímo ve vzorku, mluvíme o hybridizaci in situ (ISH), tedy v místě jejich normálního výskytu. Průběh hybridizace se pozoruje pod mikroskopem, a pokud se sonda označila fluorescenčním barvivem, jedná se o fluorescenční in situ hybridizaci (FISH).

 

9.5 Southernův, northernový a westernový přenos

 

Variantou hybridizačních technik je hybridizace na pevných podkladech. Denaturovaná DNA či RNA nebo proteiny se přenáší na pevný podklad, kterým je nitrocelulózový filtr či nylonová membrána. Nukleové kyseliny či proteiny jsou na membráně zachyceny v místech, odpovídajících jejich polohám v gelu po elektroforéze.

Vlastní hybridizaci se značenou sondou tedy předchází elektroforéza a přesávka (blotting, přenos) na pevnou podložku (obr. 33).

Obr. 33: Schéma blottingu. Přenos DNA/RNA separovaných elektroforézou na pevnou membránu.

 

Tyto metody jsou využívány k přenosu DNA (Southernův přenos), RNA (northernový přenos) a proteinů (westernový přenos).

 

9.6 Polymerázová řetězová reakce

 

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je biochemická metoda založená na principu replikace, umožňující kopírování DNA k vytváření identických kopií těchto molekul. Podstatou je cyklicky se opakující enzymová syntéza vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5ʹ-3ʹ prostřednictvím DNA polymerázy (obr. 34).

Obr. 34: Schéma reakce PCR. Cykly se opakují ve třech základních krocích: denaturace, nasednutí primerů a elongace nukleotidových řetězců.

 

Co vše potřebujeme k provedení metody PCR?

  • templátové vlákno,
  • volné dinukleotidtrifosfáty (dNTP),
  • pár primerů (krátký existující úsek druhého vlákna s volnou 3ʹ-OH skupinou) – určí DNA-polymeráze, od kterého místa a kterým směrem má začít syntetizovat komplementární vlákno,
  • termostabilní DNA-polymerázu odolávající teplotě až 98 °C,
  • Mg2+ ionty tvořící rozpustný komplex s dNTP a vytvářející substrát, který rozpoznává DNA polymeráza.

Pokud máme teoreticky na začátku dvě templátová vlákna (jednu dvouvláknovou molekulu), v prvním cyklu vzniknou dvě kopie. Pro další cyklus již tedy máme k dispozici čtyři vlákna, podle kterých vzniknou čtyři kopie.

Tímto způsobem tedy ze dvou vláken získáme po 30 cyklech celkem 230 = 107 370 000 kopií (tj. 107 mili-onů kopií). Tato metoda má však několik požadavků, které musí být spl-něny. V první řadě je to termostabilní DNA-polymeráza. Většinou pochází z bakterií žijících v extrémních podmínkách (Taq-polyme-ráza – izolovaná z bakterie Thermus aquaticus). Na začátku kaž-dého cyklus totiž musíme denaturovat templátovou DNA vysokou teplotou, která ničí normální DNA-polymerázy.

Pro reakci také potřebujeme navrhnout vhodný pár primerů, které nám budou vymezovat konkrétní úsek templátové DNA, který chceme amplifikovat (množit). Je zapotřebí, aby primery na-sedly při stejné teplotě. A nesmí tvořit dimery ani vlásenky. Dimer vzniká spárováním dvou primerů navzájem a vlásenka spárováním konců stejného primeru (obr. 35). K navržení PCR reakce se v dnešní době využívá řada softwarů.

Dále je zapotřebí přístroje, termocykleru, který automaticky řídí cyklické změny teplot reakční směsi. Mikrozkumavky, do kterých se pipetuje reakční směs, musí být tenkostěnné, aby umožňovaly rychlé změny teplot vzorku. Zkumavky jsou v termocykleru umís-těny do kovového bloku, jehož teplota je řízena podle programu, nastaveného uživatelem.

Posledním požadavkem je příprava reakční směsi tzv. „na ledu“, to znamená, že mikrozkumavka je stále chlazena na teplotu mírně nad 0 °C, aby se zabránilo předčasné aktivitě Taq-polyme-rázy. Při laboratorní teplotě totiž mohou primery nespecificky na-sednout na místa, která neodpovídají zcela jejich sekvenci, a Taq-polymeráza by mohla zahájit jejich extenzi. Vznikly by tedy nespe-cifické produkty.

Obr. 35: Primery pro PCR reakci. Primery musí být orientovány protisměrně, pouze tak mohou vymezit požadovaný úsek, který chceme v reakci amplifikovat. Primery nesmí tvořit dimery ani vlásenky.

 

Reakční podmínky PCR:

  1. Počáteční denaturace DNA. 2–5 minut/95 °C. Vlastní řetězová reakce (30×):
  2. Denaturační krok (separace řetězců): 94–95 °C/20–45 s.
  3. Připojení primerů (annealing): 55–65 °C/30–90 s.
  4. Prodlužování primery (extenze): 72 °C/45–90 s.
  5. Závěrečná extenze: 72 °C/5 min.

Výsledek PCR reakce je možné ověřit pomocí gelové elektroforézy. Pokud primery nasedly jen na vybraná protisměrně umístěná místa, vznikly jako produkty reakce molekuly stejné sekvence. V takovém případě je možné pomocí gelové elektorofézy pozorovat pouze jeden pruh.

Pokud není zobrazen žádný pruh, PCR neproběhla. Pokud je zobrazeno více pruhů, PCR proběhla, ale primery nasedly na více místech, takže došlo k amplifikaci více produktů.Metoda PCR má široké využití, a to jednak ve výzkumu, v aplikovaném výzkumu (studium polymorfizmů), i v klinických disciplínách a praxi (prenatální diagnostika, detekce mutací spojovaných s určitým typem onemocnění, archeologie, soudnictví, kriminalistika).

 

9.7 Polymerázová řetězová reakce v reálném čase

 

Při metodě real time PCR (RT-PCR) se kvantifikace amplikonu provádí prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu.

Můžeme využít interkalačních barviv vázajících se na DNA, dále fluorescenčně značených sond vázajících se na střední část amplikovaného produktu či fluorescenčně značených primerů.

Pro RT-PCR je zapotřebí termocyklerů, které jsou schopny v průběhu PCR ozařovat vzorek excitačním zářením, které vybudí fluorescenci uvolněného barviva. Tato fluorescence je přístrojem změřena a výsledek je předán řídícímu softwaru, který zobrazuje průběžně (v reálném čase) množství uvolněné fluorescence, které odpovídá množství vzniklého produktu. Není tedy nutné detektovat produkty PCR elektroforeticky.

Tento typ PCR se používá při detailním studiu genové exprese, diagnostice některých patogenů či klinické diagnostice.

 

9.8 Imunohistochemie

 

Zatímco výše uvedené metody se využívají ke zkoumání nukleových kyselin, metoda imunohistochemie se využívá k detekci proteinů v histologických řezech. Ty mohou být připraveny například z orgánů laboratorních zvířat, odebrané nádorové tkáně či potravin. Protilátky se získávají imunizací laboratorních zvířat látkami, které chceme stanovovat.

Sérum ze zvířat poté obsahuje protilátky proti danému antigenu. Podstatou této metody je právě vazba mezi antigenem a protilátkou, která je následně vizualizovaná navázaným řetězcem reakcí. Na primární protilátku se váže protilátka sekundární opatřená molekulou biotinu. V dalším kroku se přidává komplex ABC, jehož součástí je molekula avidinu a enzym křenová peroxidáza. Avidin se ochotně váže k biotinu přítomném na sekundární protilátce. Enzym křenová peroxidáza nám po dodání substrátu provede enzymatickou reakci. Substrátem je v tomto případě diaminobenzidin (DAB), který změní barvu pozitivních buněk na hnědou (obr. 36).

 

Obr. 36: Imunohistochemie. Příklad detekce proliferujících buněk na základě přítomnosti antigenu PCNA (proliferující buněčný jaderný antigen).

9.9 Microarrays

 

Tzv. čipy či microarrays jsou dosud nejmodernějšími používa-nými technikami a představují budoucnost molekulárních analýz. U těchto metod je k pevnému podkladu přichycena jednovláknová sonda, se kterou je možné hybridizovat vzorek nukleové kyseliny. Čip v tomto případě představuje destičku, na které je vedle sebe připevněno mnoho sond současně. Pokud na tento čip naneseme vyšetřovanou DNA, najednou provedeme vyšetření s celým sou-borem sond a později můžeme odečíst intenzitu vazby vyšetřované nukleové kyseliny na automatizovaných čtečkách (obr. 37).

Obr. 37: Výsledek čipu, microarrays. Výsledky jsou odečítány na automati-zovaných čtečkách, později interpretovány odbornými pracovníky.

 

Microarrays jsou využívány při sledování exprese genů při růz-ných funkčních stavech buněk.

Jejich budoucnost je především v lékařské diagnostice, kdy by měly umožnit efektivní současné vyšetření přítomnosti různých alel genů (především těch souvisejících s onemocněním) v jediném vzorku DNA od pacienta.

 

9.10 Sekvenování DNA

 

Sekvenování DNA je stanovení sekvence nukleotidů (resp. bází) v jednom z řetězců DNA (druhý řetězec je komplementární).

K základním metodám sekvenování patří Maxam-Gilbertova a Sangerova metoda.

Maxam-Gilbertova metoda je založena na specifickém rozštěpení molekuly DNA chemickými činidly v místech, kde je lokalizována báze určitého typu. Výchozím materiálem je soubor identických fragmentů jednořetězové DNA označených na jednom konci radioaktivní značkou. Každý ze čtyř typů bází v molekule DNA lze modifikovat různým způsobem, aby došlo k přerušení řetězce DNA.

Sangerova metoda využívá specifickou inhibici enzymové syntézy řetězců DNA a je označována jako enzymová metoda. Reakce je specificky upravena tak, že v určitých místech dochází k ukončení syntézy. Vzniknou tak různě dlouhé fragmenty, které jsou od sebe odděleny pomocí elektroforézy. Ukončení syntézy je zajištěno přidáním určitého poměru dideoxynukleotidtrifosfátů (ddCTP), které v porovnání s klasickými deoxynukleotidtrifosfáty (dCTP) místo 3ʹ-OH skupiny obsahují pouze 3ʹ-H, který neumožňuje další prodlužování vznikajícího řetězce. Z tohoto důvodu je tato metoda také nazývána terminační. Vhodný poměr je 100 dCTP : 1 ddCTP. Výsledkem reakce je směs nových vláken, která jsou různě dlouhá, podle toho, ve které pozici se syntéza zastavila. Sekvence je čtena ze sekvenačního gelu, ve kterém byly ve čtyřech drahách rozděleny produkty čtyř reakcí (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) (obr. 38).

Využití sekvenování je nasnadě. Pokud má nějaká choroba genetický základ, pak její konkrétní příčinou je změna zdravé alely genu v „chorobnou“. Podkladem této změny je právě konkrétní změna sekvence DNA. Podaří-li se takovou změnu po srovnání sekvencí zdravých a nemocných jedinců identifikovat, může to sloužit k vývoji diagnostického postupu, který bude tuto změnu namísto sekvenování identifikovat některou jednodušší a méně nákladnou molekulární metodou. Znalost změny sekvence, která je příčinou choroby, tak otevírá cestu k budoucí cílené léčbě genovou terapií (tj. náhradou funkce „chorobné“ alely dodáním „zdravé“ alely).

Obr. 38: Sangerovo sekvenování. Vzorky jsou rozděleny do čtyř zkumavek a reakce probíhají zvlášť (s ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP), vzniklé fragmenty jsou následně rozděleny elektroforézou a výsledky jsou odečteny.

10 Závěr

 

DNA je tedy souhrnem instrukcí zapsaných v sekvenci nukleotidů: A, T, C a G, které kódují plány k vytváření a řízení našeho těla. Autor Richard Dawkins ve své knize Sobecký gen uvádí následující přirovnání: představme si knihovnu v každé místnosti obrovské budovy. V každé knihovně je architektův plán pro celou budovu. Tato knihovna je buněčným jádrem. Plány architekta, v případě člověka, mají 46 svazků – chromozomů. Chromozomy obsahují jednotlivé geny, tedy jednotlivé stránky knihy.1 Každý gen má nejméně dvě alternativní stránky, varianty. Může se stát, že v nějakých případech jsou tyto dvě stránky identické, ale v jiných případech se liší. Pokud je jedna varianta jednoduše ignorována, označuje se jako recesivní. Protikladem je dominantní forma genu, tedy ta převládající – projevující se ve fenotypu organizmu (viditelná navenek).

Všechny teoretické znalosti o informačních molekulách a jejich vztazích napomohly obrovskému rozvoji metod molekulární biologie. Tyto metody v dnešní době usnadňují nejen detekci chorob, ale dokonce jejich predikci, tedy předpověď před jejich vznikem. Poznat DNA tedy znamená poznat celou buňku včetně buněčných pochodů a v širším smyslu také nás samotné. My jsme ve své podstatě naprogramováni k ochraně genů a k jejich předání dalším generacím. Proces předávání naší genetické informace, genů, nikdy nebude u konce, dokud bude na světě lidstvo. Procesem evoluce se pouze některé geny stávají více či méně početnými. Geny řídí i naše chování, i když ne přímo. Hlavní roli ve všech procesech našeho těla, i těch psychických, hrají proteiny, syntetizované podle genetického kódu.

Molekulárním metodám je proto věnována neustále obrovská pozornost a rozvíjejí se k stále přesnější a časnější detekci pochybení, které se staly při genové expresi. Aby to, „co kódují geny“, bylo v naprostém pořádku a s tím i život individuálního organizmu.

11 Slovníček pojmů

 

Alela = konkrétní forma genu.

Antigen = látka, která navozuje produkci jedné nebo více protilátek – jakákoli cizorodá látka vyvolávající imunitní odpověď organizmu; každá buňka má na sobě mnoho antigenních struktur.

Antikodon = odpovídá specifickému kodonu v mRNA, jsou to tři za sebou jdoucí nukleotidy v tRNA.

Antiparalelní uspořádání řetězců = řetězce dvoušroubovice DNA jsou ori-entovány opačným směrem, jeden řetězec je orientován 5ʹ-3ʹ, druhý 3ʹ-5ʹ.

Antisérum = sérum reagující s určitým antigenem, tj. obsahující protilátky proti tomuto antigenu.

Avidin = molekula, která se váže k biotinu.

Biotin = molekula, která se váže k avidinu, je součástí sekundární protilátky při metodě imunohistochemie (v některých případech může být součástí protilátky primární).

Centrální dogma molekulární biologie = cesta přenosu informace mezi biopolymery, popisuje přepis mezi nukleovými kyselinami a překlad z RNA do proteinů.

Degenerovaný genetický kód = některé varianty tripletů mohou kódovat stejný druh aminokyseliny a současně některé varianty tripletů nekódují žádnou aminokyselinu.

Denaturace = u dvouvláknové DNA se tento proces projeví jako oddělení komplementárních vláken v dvoušroubovici, obvykle probíhá za zvýšené teploty.

Deoxyribonukleová kyselina (DNA) = nukleová kyselina, nositelka genetické informace všech organizmů s výjimkou některých nebuněčných, je tvořena dvěma vlákny nukleotidů (dvoušroubovice) obsahujícími cukr deoxyribózu.

Dominance = stav, kdy je určitá alela genu dominantní, tj. schopna se prosadit v přítomnosti recesivního genu.

Dominantní homozygot = jedinec, u kterého je gen pro daný znak zastoupen pouze dominantními alelami.

Elektroforéza = separační metoda využívaná k dělení látek jejich odlišnou pohyblivostí ve stejnosměrném elektrickém poli na principu rozdílných elektroforetických mobilit, slouží pro dělení nabitých molekul.

Epistáze = jev, kdy jeden gen je nadřazen druhému a ovlivňuje jeho projev.

Expresivita = manifestace znaku odlišným způsobem u jedinců, kteří ho nesou.

Fenotyp = soubor všech pozorovatelných vlastností a znaků živého organizmu, představuje výsledek spolupůsobení genotypu a prostředí.

Gen = konkrétní úsek DNA se specifickou funkcí.

Genetická informace = informace determinovaná sekvencí deoxyribo-nukleotidů v DNA o primární struktuře proteinů, o primární struktuře tRNA a rRNA, o vazbě specifických proteinů k molekule DNA.

Genetický kód = systém pravidel, podle nichž jednotlivé kodony mRNA určují řazení aminokyselin do polypeptidu.

Genom = veškerá genetická informace uložená v DNA konkrétního organizmu, zahrnuje všechny geny a nekódující sekvence, genetická informace se nachází v jádře buňky, u živočichů dále v mitochondriích a u rostlin v chloroplastech.

Genotyp = konkrétní kombinace dědičných vloh, tedy konkrétní sestava alel na konkrétním lokusu či více lokusech, genotyp úzce souvisí s fenotypem.

Genová exprese = proces, kterým je v DNA uložená informace převedena v protein, patří do ní transkripce a translace.

Heterozygot = jedinec s nestejnými alelami určitého genu v důsledku splynutí geneticky odlišných gamet při vzniku zygoty.

Homozygot = jedinec, jehož genotyp je ve sledovaném znaku tvořen jediným typem alel.

Hybridizace = podle pravidel komplementarity se spojí vlákna DNA s druhým vláknem, kterým je nejčastěji sonda, která bývá označená.

Hyperchromní efekt = experimentální pozorování denaturace jako vzrůst UV absorpce roztoku DNA po denaturaci.

Chromatin = komplex DNA a některých proteinů (zejm. histony), tvoří chromozomy, u eukaryot se nachází v jádře buněk a u prokaryot v jaderné oblasti (nukleoid) v cytoplazmě.

Chromozom = specifická barvitelná buněčná struktura eukaryot přítomná v jádře, skládá se z DNA a histonů (chromatin).

Imunohistochemie = histologická metoda, při níž se ve vyšetřovaném vzorku tkáně prokazuje přítomnost určitých antigenů pomocí specifických protilátek s navázanými chemickými sloučeninami, které umožňují jejich průkaz, např. peroxidázová reakce.

In situ hybridizace (ISH) = metoda, která umožňuje lokalizaci a identifikaci specifické sekvence nukleotidů v DNA přímo v buňce, popř. RNA, využívá denaturaci a renaturaci.

Iniciační kodon = trojice nukleotidů (kodon), jež ribozom rozeznává jako počátek genu a začíná zde syntéza proteinu, obvykle: AUG.

Kodominance = současné vyjádření rozdílných verzí dědičných znaků (alel) u heterozygota, kodominantní jsou např. geny pro krevní skupiny A a B.

Kodon = triplet = označení tří za sebou jdoucích bází v mRNA určující druh aminokyseliny, ke každému kodonu existuje komplementární antikodon na tRNA.

Křenová peroxidáza = enzym využívající se při metodě imunohistochemie, jeho substrátem je zpravidla DAB (diaminobenzidin).

Lokus = přesné místo na chrozomozomu, na kterém se vyskytuje příslušný gen (či více genů), konkrétní varianta genu v příslušném lokusu se nazývá alela.

Microarrays = kolekce značených sond přichycených k pevnému povrchu, využívají se ke zkoumání hladiny exprese velkého počtu genů v jedné reakci najednou.

mRNA (messenger RNA, informační RNA) = jednovláknová nukleová kyselina, která vzniká během transkripce DNA a slouží jako předloha pro výrobu bílkovin.

Mutace = změna genotypu, může být spontánní či indukovaná uměle mutageny, může být dědičná i nedědičná.

Neúplná dominance = fenotyp heterozygotů je odlišný od fenotypu obou typů homozygotů.

Neúplná penetrance = pokud se znak neprojevuje, ačkoli jedinec má odpovídající genotyp.

Northernový přenos = hybridizační metoda využívaná při práci s RNA, umožňuje přenos fragmentů RNA z gelu, v němž probíhala elektroforéza, na nitrocelulózový nebo nylonový materiál (na membránu).

Nukleosid = glykosidy složené z nukleové báze a sacharidu (ribózy, deoxyribózy).

Nukleotid = fosforylovaný nukleosid, tedy látka složená z nukleové báze (purinová, pyrimidinová), pětiuhlíkatého monosacharidu (ribóza, deoxyribóza) a zbytku kyseliny fosforečné.

Nukleozom = základní stavební jednotka eukaryotického chromozomu, složená z úseku DNA ovinutého kolem jádra z histonových proteinů.

Pleiotropie = jev, kdy jeden gen ovlivňuje více fenotypových stavů.

Polyadenylační signál = sekvence AAAAAA na přepisovaném řetězci DNA, která určuje místo štěpení a polyadenylace hnRNA, slouží jako signál pro ukončení transkripce v eukaryotických transkripčních jednotkách.

Polymerázová řetězová reakce (PCR) = metoda rychlého a snadného zmnožení úseku DNA založená na principu replikace nukleových kyselin.

Posttranskripční úpravy = úpravy po úspěšném přepisu DNA do RNA, úprava konců (5ʹ-čepička, 3ʹ-polyA konec), sestřih.

Posttranslační úpravy = úpravy proteinů po jejich syntetizování v ribozomu, např. fosforylace, glykosylace, ubikvitinace, metylace atd.

Primer = řetězec nukleové kyseliny, od kterého dochází k prodlužování vlákna DNA či RNA (či reakce PCR) poskytujícího volnou 3ʹ-OH skupinu.

Protilátka = protein, který je schopen identifikovat a zneškodnit cizí objekty (imunitní systém); protein, který se váže na určitý antigen buňky.

Real-time PCR (RT-PCR) = metoda založená na klasické PCR s tím rozdílem, že speciální přístroj umožňuje kontinuálně monitorovat přírůstky DNA během každého cyklu – díky fluorescenčnímu substrátu.

Recesivita = stav, kdy je určitá alela genu recesivní, tj. neschopna se projevit v přítomnosti genu dominantního.

Recesivní homozygot = jedinec, u kterého se gen pro sledovaný znak vyskytuje pouze v recesivních alelách.

Replikace DNA = proces tvorby kopií molekuly DNA, čímž se genetická informace přenáší z jedné molekuly DNA (templát, matrice) do jiné molekuly stejného typu (replika), viz semikonzervativní a semi-diskontinuální replikace.

Replikon = úsek DNA, který je zdvojen v rámci jednoho cyklu replikace DNA a je řízen jedním počátkem replikace.

Restriktázy = původně bakteriální enzymy, které štěpí esterové vazby v řetězci dsDNA.

Ribonukleová kyselina (RNA) = nukleová kyselina tvořená vláknem nukleotidů, jež obsahují cukr ribózu, je odpovědná za přenos informace z úrovně nukleových kyselin do proteinů, u některých virů je nositelkou genetické informace.

rRNA (ribozomální RNA) = druh RNA, který se podílí spolu se specifickými proteiny na tvorbě ribozomu.

Řetězec negativní/templátový/nekódující = takové vlákno DNA, které má komplementární sekvenci k syntetizované mRNA, má funkci matrice.

Řetězec pozitivní/netemplátový/kódující = řetězec DNA, který neplní funkci matrice, má stejnou sekvenci (pouze místo T je U) jako výsledná RNA, která vzniká procesem transkripce tohoto genu.

Sekvenování = určení pořadí nukleotidových bází (A, C, G, T) v sekvencích DNA.

Semidiskontinuální replikace = jedno vlákno je syntetizováno nepřerušovaně – kontinuálně (vedoucí vlákno), druhé přerušovaně – diskontinuálně (opožďující se vlákno) za vzniku Okazakiho fragmentů.

Semikonzervativní replikace = každá nově vzniklá molekula DNA má jeden řetězec z původní molekuly a jeden nový, syntetizovaný.

Sestřih = posttranslační úprava hnRNA, odstranění intronů (nekódujících úsek) z pre-mRNA.

Southernův přenos = hybridizační metoda využívaná při práci s DNA, umožňuje přenos fragmentů DNA z gelu, v němž probíhala elektro-foréza, na nitrocelulózový nebo nylonový materiál (membránu).

Stop kodon = trojice nukleotidů (kodon), jež ribozom rozeznává jako konec genu a končí zde syntéza proteinu, obvykle: UAA, UAG, UGA.

Teplota tání = teplota, při které je denaturováno 50 % dvouřetězců DNA v roztoku.

Transkripce = přepis = proces, při kterém je podle genetické informace zapsané v řetězci DNA vyráběn řetězec RNA představující prostředníka mezi genetickým materiálem a bílkovinami, jež se podle něho vyrábí.

Translace = překlad = proces syntézy bílkovin, jde o sestavení primární struktury bílkovin (aminokyselin) podle záznamu v transkripcí vytvořené mRNA, během translace je informace zapsaná v mRNA podle přesných pravidel genetického kódu dekódována.

Tripletový genetický kód = sestaven z třínukleotidových sekvenčních jednotek (z nichž každá determinuje určitou standardní aminokyselinu anebo plní jinou funkci).

tRNA (transferová RNA) = druh RNA, která se podílí na translaci tím, že připojuje specifickou aminokyselinu do rostoucího polypeptidového řetězce.

Úplná dominance = interakce mezi alelami téhož genu, kdy funkce jedné alely úplně převládá a překrývá projev alternativní alely (recesivní).

Westernový přenos = hybridizační metoda využívaná při práci s proteiny, umožňuje přenos proteinů z gelu, v němž probíhala SDS-elektroforéza, na nitrocelulózový nebo nylonový materiál (membránu).

12 Seznam obrázků, zdroje

 

Obr. 1: Centrální dogma molekulární biologie.

Obr. 2: Uložení genetické informace. 

Obr. 3: Praktické využití oboru molekulární biologie a genetiky.

Obr. 4: Rozdíl ve strukturním vzorci deoxyribózy a ribózy

Obr. 5: Rozdíl mezi nukleosidem a nukleotidem.

Obr. 6: Polynukleotidový řetězec.

Obr. 7: Objevitelé struktury DNA.

Autor: Marjorie McCarty. Licence: Creative Commons. Dostupný na WWW: http://goo.gl/ulXjp1

Obr. 8: Komplementarita bází v DNA.

Obr. 9: Antiparalelita řetězců a jednotlivé báze.

Obr. 10: Denaturace DNA, teplota tání.

Obr. 11: Sbalování.

Obr. 12: Struktura mRNA.

Obr. 13: Struktura tRNA.

Obr. 14: Struktura rRNA.

Obr. 15: Replikace DNA.

Obr. 16: Struktura transkripční jednotky.

Obr. 17: Transkripce.

Obr. 18: Vzájemný vztah kodonu, antikodonu a aminokyseliny.

Obr. 19: Translace.

Obr. 20: Schematická struktura ribozomu.

Obr. 21: Základní typy dědičnosti.

Obr. 22: Sedm znaků hrachu pozorovaných Mendelem.

Obr 23: Dominantní a recesivní dědičnost.

Obr. 24: Alternativní sestřih.

Obr. 25: Srpkovitá anémie.

Obr. 26: Ilustrační fotografie bakteriální kultury. Dostupný na WWW: http://goo.gl/EbRwxQ

Obr. 27: Genová terapie.

Obr. 28: Výsledek izolace nukleových kyselin pomocí fenol-chloroformové extrakce.

Obr. 29: Nanodrop.

Obr. 30: Restrikční štěpení.

Obr. 31: Elektroforéza.

Obr. 32: Hybridizace se značenou sondou

Obr. 33: Schéma blottingu.

Obr. 34: Schéma reakce PCR.

Obr. 35: Primery pro PCR reakci.

Obr. 36: Imunohistochemie

Obr. 37: Výsledek čipu, microarrays. Dostupný na WWW: http://goo.gl/CU3kVQ

Obr. 38: Sangerovo sekvenování

MENDELOVA INTERAKTIVNÍ ŠKOLA

 

Pro popularizaci a šíření výsledků VaV je ideální provázanost aspektů vědce, učitele a studenta a jejich interakce, vědec by měl svoji problematiku nejenom důkladně znát, ale také ji dokázat vysvětlit na různých úrovních a měl by mít neustálý zájem o sebevzdělávání.

Mendel v rámci své mnohostranné činnosti působil jako učitel, svou školu však nikdy nezaložil. Zřejmě také proto, že uznání své práce se během svého života nedočkal.

Současná Mendelova škola využívá motivačního aspektu JGM a jeho odkazu pro splnění celkové koncepce založené na několika hlavních směrech projektu Mendelovy interaktivní školy genetiky (CZ.1.07/2.3.00/45.0037).

 

Mendelova mobilní škola (MMŠ)

MMŠ nabízí cestu vědy ke studentům. MMŠ představuje unikátní projekt pěti mobilních laboratoří, které umožní vstup vědy a výzkumu do středních škol, ve kterých se většinou formuje zájem o VaV. Mobilní laboratoře v roce 2014/2015 nabízejí cyklus na téma „Jak funguje …“, který zahrnuje:

  • Vzdělávací programy – moduly
  • Vzdělávací materiály a učební texty
  • Konzultace a stáže na SŠ

 

Mendelova vědecko-výzkumná škola (MVŠ)

MVŠ zve studenty k zapojení přímo do vědecké činnosti. MVŠ je již fungujícím projektem založeným na hands-on experience studentů přímo na pracovištích vědy a výzkumu. Aktivity jsou realizovány pod hlavičkou Věda v akci. V jarním semestru je k výročí Dne DNA nabízen cyklus Odpoledne s DNA, v podzimním u příležitosti udělování Nobelových cen cyklus Nobelovská výročí.

  • Věda v akci: Odpoledne s DNA
  • Věda v akci: Nobelovská výročí
  • Stáže na pracovištích VaV

 

Mendelova popularizační škola (MPŠ)

Mendelova popularizační škola e zaměřuje na diskusní fóra pro experty, učitele, studenty i širokou veřejnost. Organizuje každoroční cyklus populárně-vědeckých konferencí Mendel Forum a připravuje motivační výstavy. Součástí aktivit jsou diskuse u kulatého stolu s našimi i zahraničními experty a studenty. V roce 2014/2015 je tato činnost rozšířena o Junior Mendel Forum.

  • Mendel Forum
  • Round Table Discussions
  • Motivační výstavy

 

Mendelova letní škola (MLŠ)

MMŠ je novinkou, která umožňuje zábavné vzdělávání i během prázdnin s využitím zázemí Mendelova rodného domu a návštěvnického centra Mendelianum – atraktivní svět genetiky. Využívá také laboratorního vybavení MMŠ, které není SŠ přes prázdniny využíváno a je tak nabídnuto dalším zájemcům.

  • Prázdniny s vědou pro zájemce o VaV
  • Prázdninová škola – moduly mobilní školy
  • Mendelův vzdělávací víkend

 

Mendelova škola World Wide + Web (MWŠ)

  • Distanční forma prostřednictvím e-learningu
  • Vytváření funkčních sítí spolupracujících institucí
  • Uvedení školy do mezinárodního kontextu

Věda v akci: Odpoledne s DNA 2015

 

Čtvrtek 23. dubna

ÚŽFG AV ČR, v. v. i., Veveří 97, 602 00 Brno

 

13–15 h, 15–17 h

Odpoledne s interaktivním programem v laboratořích Akademie věd na téma od DNA k proteinu, od genu k funkci

 

Pátek 24. dubna

Centrum Mendelianum, Muzejní 1, 659 37 Brno

 

13–15 h, 15–17 h

Komentované prohlídky „buněčného jádra“ s využitím 3D modelů a animací DNA a replikace

Práce s DNA v molekulárně-biologické laboratoři

 

Sobota 25. dubna

www.mendel-brno.cz

Mezinárodní Den DNA – výročí zveřejnění objevu struktury DNA (1953, Nature) a „přečtení“ lidského genomu (2003)

Víkendový e-learning Mendelovy školy

 


 

Organizace Odpoledne s DNA

Autor/garant: prof. RNDr. Eva Matalová, Ph.D.

Koordinátor: PhDr. Anna Matalová

Manager: RNDr. Iva Kubištová, Ph.D.

MAPOVÁNÍ LIDSKÉHO GENOMU

 

Výsledky sekvenování lidského genomu otevírají cestu pro prevenci, diagnostiku a léčbu mnoha geneticky podmíněných nemocí. Změny v lidských genech jsou zodpovědné za několik tisíc dědičných chorob. Genetický vliv je však sledován při vzniku tisíců dalších onemocnění.

Zjištění spojitosti určitého genu s daným projevem je časově velice náročný proces, uvážíme-li, že počet genů v lidském genomu se počítá na desetitisíce. Rozvoj vědeckého poznání, technologie a bioinformatiky tento proces stále výrazněji zefektivňuje. V roce 1989 nalezli vědci po 9 letech práce gen pro cystickou fibrózu. Díky rychlému rozvoji, mezinárodnímu propojení a koordinaci výzkumu byl např. gen pro Parkinsonovu chorobu zmapován za pouhých 9 dní.

 

Co zahrnuje mapování lidského genomu?

  • Identifikaci genů na lidských chromozomech
  • Určení sekvence chemických bází v lidské DNA
  • Ukládání všech získaných informací do databází
  • Zkvalitňování nástrojů pro analýzu dat
  • Přenos souvisejících technologií do privátního sektoru
  • Řešení etických, právních a společenských otázek

Projekt mapování lidského genomu (Human Genome Project) byl zahájen v říjnu 1990 a byl plánován na 15 let. Vzhledem k prudkému rozvoji technologií však bylo vytčených cílů dosaženo již v roce 2003, kdy byl projekt oficiálně ukončen. Nicméně navazující výzkum stále bouřlivě pokračuje, zejména v oblastech určení funkce identifikovaných genů a jejich interakcí na různých úrovních exprese.

 

Milníky:

1983 začátek DNA knihoven, PCR (polymerázová řetězová reakce)

1984 rozvoj rekombinantních DNA technologií

1985 odborné setkání týkající se sekvenování lidského genomu

1986 první oficiální konference „Sekvenování lidského genomu“, finanční prostředky na pilotní projekty

1987 návrh 15letého multidisciplinárního vědeckého a technologického plánu na mapování a sekvenování lidského genomu

1988 založení HUGO (HUman Genome Organisation) s cílem mezinárodní koordinace mapování lidského genomu, osekvenovány telomerové části chromozomů

1989 nová strategie pro sekvenování (STS - Sequence Tagged Site), STS je krátká sekvence DNA, která jednoznačně identifikuje mapovaný gen – urychlení a zjednodušení fyzického mapování chromozomů, založení ELSI (Ethical, Legal and Social Issues) pro etické, právní a společenské otázky související s mapováním genomu

Mapování genomů probíhá nejenom u člověka, ale i dalších savců (Mammalian Genome Project, např. laboratorní myši (2002), laboratorního potkana (2004) nebo šimpanze (2005).

V současnosti je realizována řada dalších projektů, např. Human Microbiome Project – Projekt lidského mikrobiomu, který má za cíl zmapování mikrobiálního osídlení organismu člověka http://nihroad-map.nih.gov/hmp/) a další.

Příklady využití výsledků mapování lidského genomu

 

Molekulární medicína:

  • Prevence a včasná diagnostika u pacientů s rizikem vzniku choroby.
  • Predikce průběhu choroby a navržení léčebného postupu.
  • Aplikace nejefektivnějšího léčebného postupu (léky „na míru“ daného genomu).
  • Genové terapie.
  • Další.

 

Forenzní medicína:

  • Identifikace každého individua.
  • Průkaz přítomnosti dané DNA.
  • Další.

 

Evoluční studia:

  • Příbuznost druhů atp.
  • Rodokmeny.
  • Srovnávací studie.
  • Další.

 

Prenatální diagnostika:

  • Predikce, prevence, terapie.